Proces srážení proteinů neutrálními solemi (vysoké koncentrace solí alkalických kovů a kovů alkalických zemin) se nazývá vysolování. Mechanismus spočívá v tom, že přidané anionty a kationty solného roztoku odstraňují hydratační obal proteinů a náboj, což jsou faktory stability.
Charakteristickým znakem proteinů získaných vysolením je, že si po odstranění soli zachovávají své přirozené biologické vlastnosti. Vysolování proteinů je vratná reakce, protože proteinová sraženina se může po snížení koncentrace soli dialýzou nebo zředěním vodou znovu rozpustit.
V lékařské praxi se k vysolování nejčastěji používá síran amonný nebo sodný (vysoké koncentrace). Albuminy se vysrážejí při 100% nasycení (NH4)2SO4. Globuliny – v polonasyceném roztoku (NH4)2SO4.
Vysolování je široce používáno pro separaci a čištění proteinů ve vědeckém výzkumu a lékařské praxi.
Pojem denaturace, faktory způsobující denaturaci, mechanismus, reverzibilita, aplikace
reakce srážení proteinu pro jeho detekci v biologických tekutinách.
Destrukce proteinové struktury a ztráta jejích nativních vlastností (biologických, fyzikálně-chemických) se nazývá denaturace. Vysrážený denaturovaný protein, na rozdíl od proteinu vysráženého vysolením, ztrácí své přirozené vlastnosti. Denaturační faktory se dělí na:
1) fyzikální (teplota, záření, ultrafialové záření)
2) mechanické (vibrace atd.)
3) chemické (koncentrované kyseliny, zásady, soli těžkých kovů atd.)
Při krátkém působení a rychlém odstranění denaturačních činidel je možná renaturace proteinu s kompletním obnovením původní trojrozměrné struktury a nativních vlastností jeho molekuly.
Denaturace se používá ke stanovení bílkovin v moči při onemocněních ledvin (pyelonefritida), močového měchýře (cystitida), prostaty (prostatitida) a také při otravách solemi těžkých kovů.
Metoda vysolování se používá v klinických laboratořích k separaci albuminů a globulinů a stanovení jejich poměru v krevním séru.
1. Pomocí procesu mírné denaturace se používá k výrobě a skladování enzymů při nízkých teplotách.
2. v lékařství se denaturace používá k vysrážení cizích bílkovin na popáleniny a omrzliny.
Způsoby izolace a čištění proteinů.
1. Selektivní denaturace. Mnoho proteinů se denaturuje a vysráží, když se roztok zahřeje na 50-70 °C nebo když se okyselí na pH ≈ 5. Pokud izolovaný protein odolá těmto podmínkám, pak mohou být některé cizorodé proteiny z roztoku odstraněny tímto způsobem.
2. Vysolování je proces vysrážení bílkovin z roztoku přidáním různých solí. Nejčastěji se využívá závislosti rozpustnosti bílkovin na koncentraci síranu amonného. Pokud je malé množství (NH4)2SO4, (například 10 g na 100 ml roztoku), pak se vysrážejí nejméně rozpustné bílkoviny. Sraženina se oddělí odstředěním a dalších 10 g (NH4)2S04 a získá se druhá sraženina. Při pokračování tohoto postupu se získá řada frakcí: jedna z nich obsahuje více požadovaného proteinu než ostatní.
3. Metody iontoměničové chromatografie a elektroforézy jsou založeny na rozdílech v množství a povaze ionogenních skupin aminokyselinových radikálů. Pro proteinovou chromatografii se používají iontoměniče na bázi celulózy nebo jiných hydrofilních polymerů.
Elektroforéza se používá různými způsoby. Nejjednodušší z nich je elektroforéza na papíře. Proužek filtračního papíru je napuštěn tlumivým roztokem a připojen k elektrickému obvodu se stejnosměrným proudem. Postup se provádí v hermeticky uzavřené komoře. Proteiny z elektroferogramu se detekují ošetřením proužku barvivem, které se váže na proteiny a vytváří barevné sloučeniny. Po konečném rozdělení proteinů do frakcí, v závislosti na náboji molekuly proteinu, se jednotlivé proteiny vymyjí (po rozřezání proužku na kousky) vhodným rozpouštědlem a vysrážejí. K získání velkého množství purifikovaného proteinu místo proužku papíru používá tato metoda tlustý blok nějakého inertního materiálu – škrob, celulózový prášek nebo polymery tvořící gely – agar, polyakrylamid.
4. Gelová filtrace a ultracentrifugační metody jsou založeny na rozdílech v molekulové hmotnosti proteinů.
Čištění proteinů selektivní denaturací
Většina proteinů denaturuje a vysráží se i při krátkém zahřátí roztoku na 50-70 °C nebo okyselení roztoku na pH 5. Pokud izolovaný protein odolá těmto podmínkám, je možné pomocí selektivní denaturace odstranit většinu cizorodých proteinů odfiltrováním vysrážených proteinů nebo jejich sedimentací centrifugací.
Způsob čištění proteinů založený na rozdílech v jejich rozpustnosti při různých koncentracích solí v roztoku. Soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin způsobují vratné vysrážení proteinů, tzn. po jejich odstranění získávají proteiny opět schopnost se rozpouštět, přičemž si zachovávají své nativní vlastnosti.
Nejčastěji jsou různé koncentrace solí síranu amonného – (NH4)2SO4. Čím vyšší je rozpustnost proteinu, tím vyšší je koncentrace soli potřebná k jeho vysolení.
Gelová filtrace nebo metoda molekulárního síta
K separaci proteinů se často používají chromatografické metody založené na distribuci látek mezi dvě fáze, z nichž jedna je mobilní a druhá nepohyblivá. Chromatografické metody jsou založeny na různých principech: gelová filtrace, iontová výměna, adsorpce, biologická afinita.
Metoda separace proteinů pomocí gelové filtrační chromatografie je založena na skutečnosti, že látky, které se liší molekulovou hmotností, jsou distribuovány rozdílně mezi stacionární a mobilní fází. Chromatografická kolona je naplněna granulemi porézní látky (Sephadex, agaróza atd.). Ve struktuře polysacharidu se tvoří příčné vazby a vznikají granule s „póry“, kterými snadno prochází voda a nízkomolekulární látky. V závislosti na podmínkách mohou vznikat granule s různou velikostí „pórů“.
Stacionární fáze je kapalina uvnitř granulí, do které mohou pronikat nízkomolekulární látky a proteiny s nízkou molekulovou hmotností. Proteinová směs nanesená na chromatografickou kolonu se promyje (eluuje) průchodem rozpouštědla přes kolonu. Spolu s přední stranou rozpouštědla se pohybují i největší molekuly.
Menší molekuly difundují do granulí Sephadexu a po určitou dobu se dostávají do stacionární fáze, v důsledku čehož je jejich pohyb zpožděn. Velikost pórů určuje velikost molekul, které mohou proniknout dovnitř granulí.
Protože se gelová struktura Sephadexu pod tlakem snadno deformuje, začaly být gely nahrazovány pevnějšími matricemi (Sefactil, Toy-Operl), což jsou kulovité granule s různou velikostí pórů. Volba velikosti pórů v granulích závisí na účelu chromatografie.
Ultracentrifugace
Separační metoda je také založena na rozdílech v molekulových hmotnostech proteinů. Rychlost sedimentace látek při rotaci v ultracentrifuze, kde odstředivé zrychlení dosahuje 100 000-500 000 g, je úměrná jejich molekulové hmotnosti. Na povrch tlumivého roztoku umístěného v kyvetě se nanese tenká vrstva proteinové směsi. Kyveta se umístí do rotoru ultracentrifugy. Když se rotor otáčí 10-12 hodin, větší molekuly (s vyšší molekulovou hmotností) se rychleji usazují v roztoku pufru. Výsledkem je, že proteinová směs je v kyvetě rozdělena na samostatné frakce s různou molekulovou hmotností. Po oddělení proteinových frakcí se dno kyvety zahřeje jehlou a obsah se po kapkách sbírá po malých dávkách do zkumavek.
Elektroforéza proteinů
Metoda je založena na tom, že při určité hodnotě pH a iontové síle roztoku se proteiny pohybují v elektrickém poli rychlostí úměrnou jejich celkovému náboji. Proteiny s čistým záporným nábojem se pohybují směrem k anodě (+) a kladně nabité proteiny se pohybují směrem ke katodě (-).
Elektroforéza se provádí na různých médiích: papír, škrobový gel, polyakrylamidový gel atd.
Existují kladně nabité aniontoměniče, mezi nimiž se nejčastěji používá dietylaminoethylcelulóza (DEAE-celulóza), obsahující kationtové skupiny, a záporně nabité katexy, například karboxymethylcelulóza (CM-celulóza), obsahující aniontové skupiny.
Volba iontoměniče je určena nábojem uvolňovaného proteinu. K izolaci záporně nabitého proteinu se tedy používá aniontoměnič. Když roztok proteinu prochází kolonou, závisí síla vazby proteinu na aniontoměnič na počtu záporně nabitých karboxylových skupin v molekule. Proteiny adsorbované na anexu lze smývat (eluovat) tlumivými roztoky s různou koncentrací solí, nejčastěji NaCl, a různými hodnotami pH. Chlorové ionty se vážou na kladně nabité funkční skupiny aniontoměniče a vytěsňují karboxylové skupiny proteinů. Při nízkých koncentracích soli se eluují proteiny slabě vázané na aniontoměnič. Postupné zvyšování koncentrace soli nebo změna pH, která mění náboj molekuly proteinu, vede k uvolňování proteinových frakcí, z nichž jedna obsahuje požadovaný protein.
Afinitní chromatografie nebo afinitní chromatografie
Jedná se o nejspecifičtější způsob izolace jednotlivých proteinů, založený na selektivní interakci proteinů s ligandy připojenými (imobilizovanými) na pevný podklad. Substrát nebo koenzym lze použít jako ligand, pokud je izolován jakýkoli enzym, antigeny pro izolaci protilátek atd. Roztok obsahující směs proteinů prochází kolonou naplněnou imobilizovaným ligandem. K ligandu je připojen pouze protein, který s ním specificky interaguje; všechny ostatní proteiny vycházejí s eluátem. Protein adsorbovaný na koloně lze odstranit promytím roztokem se změněnou hodnotou pH nebo změněnou iontovou silou. V některých případech se k přerušení hydrofobních vazeb mezi proteinem a ligandem používá roztok detergentu.
Je známo, že proteiny v roztoku jsou zachovány ve svém přirozeném stavu díky faktorům stability, které zahrnují náboj molekuly proteinu a hydratační (vodný) obal kolem ní. Odstranění těchto faktorů způsobí, že se tyto proteinové molekuly slepí a vysrážejí. Precipitace proteinů může být reverzibilní nebo nevratná v závislosti na povaze použitých činidel.
Reverzibilní depozice – při tomto procesu se vlivem precipitačních faktorů bílkoviny vysrážejí, ale po ukončení působení těchto faktorů přecházejí bílkoviny opět do rozpustného stavu a získávají své nativní vlastnosti. Jedním typem reverzibilního srážení proteinů je vysolování.
Nevratná depozice proteinů je spojeno s hlubokými poruchami ve struktuře proteinů (sekundárních a terciárních) a ztrátou jejich přirozených vlastností. Takové změny v bílkovinách mohou být způsobeny varem, působením koncentrovaných roztoků minerálních a organických kyselin a solí těžkých kovů.
K vysolování bílkovin se používají soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin (v praxi se nejčastěji používá síran sodný a amonný). Tyto soli odstraňují vodní povlak (způsobující dehydrataci) a odstraňují náboj. Existuje přímý vztah mezi velikostí vodního obalu proteinových molekul a koncentrací solí: čím menší je hydratační obal, tím méně solí je potřeba. Takže globuliny, které mají velké a těžké molekuly a malý vodný obal, se srážejí, když roztok není úplně nasycený solemi, a albuminy, což jsou menší molekuly obklopené velkým vodným obalem, se srážejí, když je roztok úplně nasycený.
Denaturace bílkovin (nevratná depozice) dochází k destrukci terciární a částečně sekundární struktury molekuly proteinu v důsledku prasknutí vodíkových vazeb a ztráty jejích biologických nebo nativních vlastností. Během nevratných srážecích reakcí procházejí proteiny hlubokými změnami a nemohou být rozpustné v původním rozpouštědle. Nevratné reakce zahrnují srážení proteinů solemi těžkých kovů, minerálními a organickými kyselinami, alkaloidovými činidly a srážení během varu.
Pokus 1. Vysolení proteinů síranem amonným.
Princip metody. Vysolování je přidání neutrálních solí (Na2SO4, (NH4)2SO4). Mechanismus vysolování zahrnuje interakci aniontů (SO4 2–) a kationty (Na+, NH4 + ) s proteinovými náboji (NH skupiny4 + a COO – ). V důsledku toho zmizí náboj, a tudíž zmizí vzájemné odpuzování molekul. Současně se prudce snižuje hydratační skořápka. To vše vede k „slepení“ molekul a srážení.
Albuminová frakce proteinů se vysráží nasyceným roztokem síranu amonného a globulinová frakce se vysráží polonasyceným roztokem.
Podstatou reakce je dehydratace molekul bílkovin.
30 kapek neředěného vaječného bílku se nalije do zkumavky a přidá se stejné množství nasyceného roztoku síranu amonného. Obsah zkumavky se promíchá. V tomto případě se vysráží albuminová frakce proteinů.
Získá se polonasycený roztok síranu amonného, který se také smíchá (1:1) s vaječným bílkem, přičemž se globulinová frakce vysráží a albuminová frakce zůstane v roztoku. Ten se filtruje, poté se smíchá s práškem síranu amonného, dokud se sůl nepřestane rozpouštět, a nevytvoří se sraženina – albumin.
Ke vzniklým sraženinám (globuliny a albuminy) se přidá voda a sleduje se jejich rozpouštění. To dokazuje, že vysolování je vratný proces.
Návrh pokusu: zapište si výsledky pokusu do sešitu a udělejte závěr.
Pokus 2. Vysolení proteinů chloridem sodným a síranem hořečnatým.
Princip metody. Pro vysolování bílkovin používané roztoky jsou chlorid sodný, síran sodný, octan sodný, síran hořečnatý, octan draselný, chlorid vápenatý, dusičnan vápenatý a síran amonný. Některé z uvedených solí vysolují proteiny nejen tehdy, když je jimi roztok nasycen; Některé proteiny jsou vysoleny i při poměrně nízkých koncentracích soli. Tyto soli zahrnují síran amonný. Podmínky, za kterých dochází k vysrážení síranem amonným, jsou natolik charakteristické pro jednotlivé proteiny (až na vzácné výjimky), že tuto vlastnost proteinů lze srovnat s rozpustností, která charakterizuje krystalické látky.
Proteiny se skládají z aminokyselin, a proto mají amfoterní vlastnosti. Když jsou proteiny rozpuštěny ve vodě, vodíkový iont vzniklý disociaci karboxylové skupiny se přidá k aminoskupině. Proto molekuly proteinů nesou pozitivní i negativní náboje. Množství náboje je určeno počtem ionogenních skupin. Při určité hodnotě pH je celkový elektrický náboj molekuly proteinu nulový. Tato hodnota pH se nazývá izoelektrický bod (pJ). V izoelektrickém bodě mají proteinové roztoky minimální stabilitu, protože jim chybí hlavní stabilizační faktor – náboj, a proto se snadno srážejí. Izoelektrický bod proteinu lze určit stanovením pH, při kterém má proteinový roztok největší zákal. U většiny proteinů leží izoelektrický bod v mírně kyselém prostředí.
Srážení bílkovin NaCl a MgSO4 – chlorid sodný a síran hořečnatý, na rozdíl od síranu amonného, srážejí globuliny z nasyceného roztoku. V izoelektrickém bodě se globuliny vysrážejí stejnými solemi v nižší koncentraci.
2 ml 5% roztoku proteinu se nalije do 1 zkumavek, přidá se za míchání až do úplného nasycení (kdy některé krystaly i přes třepání zůstanou nerozpuštěné) do jedné zkumavky jemně mletý chlorid sodný, do druhé síran hořečnatý. Po několika minutách se ve dvou zkumavkách objeví sraženina. globuliny. Sraženiny se odfiltrují a přidá se několik kapek zředěné kyseliny octové (CH3COOH) – v mírně kyselém prostředí se srážejí albuminy, protože pH roztoku albuminu se přiblíží izoelektrický bod.
Ve vodném roztoku proteinů jsou jejich částice nabité a vysoce hydratované, což určuje stabilitu roztoků proteinů. Ale při vysoké koncentraci solí, jejichž ionty jsou také vysoce hydratované, jsou vodní obaly molekul bílkovin zničeny a náboj je z molekuly bílkovin odstraněn ionty solí, které jsou na ní adsorbovány.
V důsledku těchto dvou procesů ztrácejí proteinové roztoky stabilitu, proteinové částice se slepují, zvětšují se a nakonec se tvoří sraženina.
Návrh pokusu: zapište si výsledky pokusu do sešitu a udělejte závěr.
Pokus 3. Koagulace bílkovin při zahřívání.
Princip metody. Srážení bílkovin při zahřívání je charakteristické téměř pro všechny bílkoviny (výjimkou je želatina, která se při zahřívání nesráží). Precipitace proteinů probíhá obzvláště snadno a úplněji v mírně kyselém prostředí, blízko izoelektrického bodu. V neutrálním a silně kyselém prostředí je srážení bílkovin mnohem horší a v alkalickém prostředí není pozorováno vůbec.
V alkalickém prostředí se snižuje disociace proteinu na radikály diaminokyselin, jeho molekuly získávají negativní náboj, v důsledku čehož zůstávají v roztoku i při zahřátí k varu.
Přídavek neutrálních solí (NaCl) do proteinového roztoku usnadňuje a urychluje koagulaci proteinů během varu v důsledku následné dehydratace proteinových částic.
5 ml se nalijí do 2 zkumavek. protein: první zkumavka se zahřeje, sraženina se objeví ještě dříve, než se kapalina uvaří. Do druhé zkumavky přidejte 1 kapku 1% roztoku kyseliny octové (CH).3COOH) a teplo. Flokulentní sraženina proteinu vypadává rychleji a úplněji než v první zkumavce díky tomu, že při okyselení se pH roztoku blíží izoelektrickému bodu proteinu (náboj proteinu = 0). Přidejte 0,5 ml do třetí zkumavky. 10% kyselina octová (CH3COOH) a teplo. Ani při varu se netvoří sraženina. Přidejte 0,5 ml do čtvrté zkumavky. 10% kyselina octová (CH3COOH) a několik kapek nasyceného roztoku chloridu sodného a zahřejte. Je tam sediment. Přidejte 0,5 ml do páté zkumavky. 10% alkalický roztok a teplo. Ani při varu se netvoří sediment. Registrace práce.
